МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ФГОУ ВПО ВОРОНЕЖСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени К. Д. ГЛИНКИ Факультет ветеринарной медицины Кафедра эпизоотологии и вирусологии Микробиология растительных кормов и продуктов животного происхождения (методические указания для самостоятельной работы студентов факультета технологии животноводства и товароведения очной и заочной форм обучения по дисциплине «Микробиология») Воронеж 2011 Составители: доценты Манжурина О. А., Скогорева А. М., Жмуров Н. Г. Рецензент: заведующий кафедрой ветеринарно-санитарной экспертизы и зоогигиены, профессор Алтухов Н. М. Одобрены и рекомендованы к изданию кафедрой эпизоотологии и вирусологии (протокол № 3 от 5.11.2010 г.), методической комиссией факультета ветеринарной медицины (протокол № методической комиссией факультета технологии товароведения (протокол № 10 от 29.03. 2011 г.) 2 11 от 10.12.2010 г.), животноводства и Занятие 5. Микробиология кормов растительного происхождения 1.Эпифитная микрофлора кормовых растений и зерна. 2.Микробиологические процессы при дрожжевании и силосовании растительных кормов. Задание 1.Приготовить разведения хорошего и плохого силоса 1:10 в стерильных фарфоровых ступках. 2.Определить рН силоса универсальным бумажным индикатором. 3.Приготовить мазки из разведений 1:10 хорошего и плохого силоса, окрасить по Граму, промикроскопировать и зарисовать. 4.Сравнить количественный и качественный состав микрофлоры хорошего и плохого силоса. 5.Приготовить мазки из картофельной среды с посевами хорошего и плохого силоса для обнаружения маслянокислых микробов. Окрасить по Граму, промикроскопировать и зарисовать. 6.Приготовить «раздавленные» капли в 50% растворе глицерина из соскобов с плесневелого зерна и сена. Промикроскопировать и зарисовать. 7.Провести органолептическую оценку силоса. Результаты записать в таблицу. Оценить качество силоса в баллах. Материальное обеспечение 1.Весы с разновесами и пинцетами – 2 шт. 2.Стерильная бумага (10×10 см) – 10 шт. 3.Пинцеты стерильные – 2 шт. На 2 студентов: 1.Тампонница с плохим и хорошим силосом – 1 шт. 2.Чашка Петри с плесневелым зерном – 1 шт. 3.Чашка Петри с плесневелым сеном – 1 шт. 4.6 пробирок в штативе (в каждой по 9 мл стерильной воды). 5.Пробирка с посевом силоса на среде Рушмана. 6.Раствор глицерина 50% с пастеровской пипеткой и баллоном – 1 шт. 7.Скальпель – 1 шт. 8.Пинцет – 1 шт. 9.Дрожжеванный корм в пробирке (10 мл) – 1. 10.Ступка с пестиком стерильные – 1. 11.Индикаторная бумажка – 1. 3 12.Препаровальные иглы – 2. 13.Физиологический раствор в пробирке – 1. 14.Чашка МПА (20 мл) с посевом силоса (выросшие колонии) – 1. 15.Стекла предметные – 6. 16.Стекла покровные – 3. 17.Краски по Граму, метиленовая синька. 18.Фильтровальная бумага – 4. 19.Спиртовка со спиртом – 2. 20.Спички – 1 коробка. 21.Бактериологическая петля – 2. 22.Карандаш по стеклу – 2. 23. Микроскопы – 2. 24.Иммерсионное масло – 1 флакон. 25.Бензиновые тампоны – 5 шт. Материалом для исследования являются пробы различных кормов из хранилищ, остатки корма в кормушках, комбикорма, содержимое желудочнокишечного тракта. Отбор проб кормов для исследования проводят комиссионно. Общая масса пробы корма для микологических и токсикологических исследований должна быть 0,5 – 1 кг. Пробу помещают в стеклянную посуду, полиэтиленовые пакеты. Пишут сопроводительную к отобранным пробам корма. Схема исследования корма: 1) 2) 3) 4) органолептическое исследование; микроскопия; выделение чистой культуры микробов; определение токсичности корма. Микрофлора, обитающая на растениях, называется эпифитной. Ее изучают для того, чтобы знать видовой состав микробов, их влияние на качество консервированных кормов, а также выявить токсигенных микроорганизмов. Исследование зерна на наличие плесневых грибов На предметное стекло нанести пипеткой каплю 50% водного раствора глицерина. Пинцетом взять плесневелое зерно и скальпелем сделать соскоб с поверхности зерна в каплю раствора. Накрыть покровным стеклом. Рассматривать раздавленную каплю, используя обьективы ×8, ×40. Поле зрения микроскопа слегка затемнить диафрагмой. Исследование сена и соломы на наличие плесневых грибов проводят так же, как и зерна. 4 Микрофлора силоса Скошенная зеленая масса растений содержит разнообразную микрофлору. В процессе созревания силоса микрофлора его меняется по фазам. Фаза смешанной микрофлоры. В силосуемой зеленой массе содержится большое количество сахаров, имеется белок, при трамбовке выделяется значительное количество сока растений. Все микроорганизмы в таких благоприятных условиях начинают активно размножаться. Фаза молочнокислых микробов. Через 1-2 суток после закладки силосуемой массы в ней создаются анаэробные условия. Молочнокислые микроорганизмы сбраживают сахара, и в массе накапливается молочная кислота, которая угнетает развитие многих микробов, в том числе и гнилостных. Фаза молочнокислых микробов делится на две стадии: - молочнокислых кокков – они выделяют молочную кислоту, от которой сами через некоторое время погибают; - молочнокислых палочек – эти микроорганизмы выдерживают более высокие концентрации молочной кислоты и всегда находятся в силосе после отмирания молочнокислых кокков. Фаза грибов. Если силос раскрыть и дать доступ кислороду, то в силосе происходит прорастание спор плесневых грибов. Установлено, что плесневые грибы питаются органическими кислотами, в данном случае – молочной и уксусной, и поэтому рН силоса в этой фазе сдвигается в щелочную сторону. Фаза гнилостной микрофлоры. В щелочной среде начинает развиваться различная гнилостная микрофлора, и корм приобретает неприятный запах и вкус. Такой силос нельзя скармливать животным. Исследование силоса Пробы силоса берут во время закладки зеленой массы, а также через 10-15 дней после вскрытия силоса, на расстоянии 1 метра сверху и снизу и со средины. Материал помещают в стерильные банки с притертой пробкой комиссионно. В сопроводительной обязательно указывают: адрес лаборатории, в которую направляют силос, место отбора проб, описание проб, на что исследовать и обратный адрес, должности и подписи лиц, отбиравших пробы силоса. В стерильную ступку вносят 1 г силоса и 9 мл стерильной воды. Силос растирают пестиком. Из растертой массы делают мазок и окрашивают по Граму. Из разведения 1:10 делают посев 1 мл жидкости на МПА для определения общего количества микробов в 1 г силоса. Качественные исследования микрофлоры силоса преследуют цель выявить, какие виды микробов находятся в силосе. Обычно исследуют силос на наличие той микрофлоры, от которой зависит качество силоса: молочнокислые, маслянокислые, гнилостные, газообразующие, кишечные палочки и др. 5 Молочнокислые микробы – силосный сок высевают на стерильное обезжиренное молоко и молочный агар. После культивирования в термостате изучают характер сгустка молока, количество сыворотки, наличие газов. Из молочных сред готовят мазки и окрашивают по Граму (грамположительные стрептококки и палочки). Маслянокислые микробы – силосный сок засевают на среду Рушмана. Это картофельная среда с мелом. При наличии маслянокислых микробов среда просветляется и выделяется значительное количество газа. Из среды Рушмана делают мазок и окрашивают по Граму (грамположительные, спорообразующие палочки). Определение токсина ботулизма – силосный сок выпаивают морским свинкам. Если в соке имеется токсин, то морские свинки погибают в течение 3-5 суток. Наличие плесневых грибов на силосе определяется следующим образом: на предметное стекло наносят каплю 50% водного раствора глицерина, в которую помещают соскоб с плесневых кормов, и накрывают покровным стеклом. Микроскопируют раздавленную каплю, используя объектив ×8 или ×40 (см. практикум по микробиологии). Дрожжевание корма Дрожжи неприхотливы к среде обитания. Их можно выращивать на отходах сельскохозяйственного производства. Они содержат много легкоусвояемого белка, витамины А, В, Е и эргостерина, который переходит в витамин Д. Кроме добавления в рацион сухих дрожжей, проводят дрожжевание корма. Для активного процесса дрожжевания необходимы определенные условия. Корм должен быть измельчен, влажный, теплый (+25,+270С), с обязательной аэрацией массы, рН среды должна составлять 3,8 – 4,2 и содержать достаточное количество моно- и дисахаридов. Одновременно с дрожжами развиваются и молочнокислые микробы. Возможно обогащение корма белком за счет минерального азота. Дрожжи могут использовать соли аммония и обогащать корм белком на 13 – 15% в расчете на сухое вещество. Само дрожжевание делает корм приятно кислым, обогащает витаминами, возбуждает аппетит, улучшает продуктивность животных. Из дрожжеванного корма берут бактериологической петлей каплю жидкости и готовят мазок на предметном стекле. Мазок высушивают, фиксируют и окрашивают метиленовой синькой. При микроскопировании определяют степень законченности процесса брожения. Если процесс брожения завершен, то в поле зрения микроскопа отсутствуют почкующиеся дрожжевые клетки. Такой корм готов к скармливанию. 6 Оценка качества силоса в баллах (см. практикум) № проб. Проба №1 Проба №2 рН Консис тенция Запах Цвет Кол-во микробов Сумма баллов Качество силоса Занятие 6. Микрофлора продуктов животного происхождения План занятия 1.Облигатная и факультативная микрофлора молока. 2.Правила отбора молока для бактериологического исследования. 3.Микробиология молочнокислых продуктов. 4.Микрофлора мяса. 5.Микрофлора яиц. Задание 1.Приготовить мазки из пастеризованного и непастеризованного молока. Окрасить метиленовой синькой, промикроскопировать и зарисовать. 2.Поставить редуктазную пробу с пастеризованным и непастеризованным молоком. 3.Приготовить мазки из сметаны и простокваши. Зафиксировать спиртэфиром, окрасить метиленовой синькой, промикроскопировать и зарисовать. 4.Прочитать кольцевую РА с молоком на бруцеллез. (Демонстрация). 5.Определить коли-титр молока на среде Булира. (Демонстрация). 6.Промикроскопировать и зарисовать мазки из молока от коров, больных бруцеллезом и туберкулезом, окрашенные по Козловскому и по ЦильНильсену. 7.Сравнить количественный и качественный состав микроорганизмов в доброкачественном и недоброкачественном мясе. Для этой цели приготовить мазки-отпечатки и окрасить по Граму. Промикроскопировать и зарисовать. 8.Приготовить разведение белка 1:10 из испорченного яйца. Сделать мазок. Окрасить по Граму, промикроскопировать и зарисовать. 7 Материальное обеспечение На демонстрационный стол: 1.Положительная и отрицательная кольцевая РА с молоком на бруцеллез. 2.Среда Булира с посевом молока для определения коли-титра. 3.Демонстрационные микроскопы с мазками молока, окрашенными по ЦильНильсену и Козловскому (настроенные и с указателями) – 2. 4.Спиртовые тампоны – 5. На 2 студентов: 1.Пастеризованное молоко 10 мл – 1 пробирка. 2.Непастеризованное молоко 10 мл – 1 пробирка. 3.Простокваша 10 мл – 1 пробирка. 4.Сметана 5 мл – 1 пробирка. 5.Пипетки мерные стерильные по 5 мл – 2 шт. 6.Пипетки мерные стерильные по 1 мл – 2 шт. 7.Мазки из молока от больных туберкулезом и бруцеллезом коров, окрашенные по Циль-Нильсену и по Козловскому – по 1 мазку. 8.Спирт-эфир для фиксации мазков в банках с притертыми пробками (100 мл) – 1. 9.Метиленовая синька (5 мл насыщенного раствора + 195 мл дистиллированной воды) – 10 мл. 10.Спиртовки – 2. 11.Бактериологические петли – 2. 12.Спички – 1 коробка. 13.Бумага фильтровальная -10 шт. 14.Предметные стекла – 10 шт. 15.Микроскопы – 2. 16.Масло иммерсионное – 1 флакон. 17.Метиленовая синька – 1 флакон. 18.Штатив с двумя пробирками стерильной воды по 9 мл. 19.Бензиновые тампоны – 4. 20.Пастеровские пипетки с баллонами – 2 шт. 21.Стерильная чашка Петри – 1 (на подгруппу). 22.Испорченное яйцо – 1. 23.Доброкачественное яйцо – 1. 24.Испорченное мясо 5×5 см в чашке Петри. 25.Доброкачественное мясо 5×5 см в чашке Петри. 26.Краски по Граму. Метиленовая синька. Микрофлора молока и молочнокислых продуктов Молоко является хорошей питательной средой для развития микроорганизмов. При температуре +18, +250С в молоке бурно размножается разнообразная микрофлора, происходят количественные и качественные 8 изменения микроорганизмов, которые зависят от температуры хранения молока, а также первичного состава микрофлоры. Из сборного молока после перемешивания для анализа берут в стерильную посуду 500 мл молока. В лабораторию можно отправлять охлажденное до +60С молоко. На каждую пробу молока пишут сопроводительную, в которой указывают: адрес ветеринарной лаборатории, объем молока в мл, температуру молока, сборное молоко или от отдельной коровы, ее номер, кличку, кому принадлежит животное, на что исследовать, обратный адрес, должность и подпись лица, отбиравшего материал для исследования, дату. Молоко исследуют не позднее 4 часов после взятия пробы. Определение общей микробной загрязненности молока редуктазной пробой В одну пробирку налить 10 мл непастеризованного молока. Во вторую пробирку налить 10 мл пастеризованного молока. В каждую пробирку добавить по 0,5 мл рабочего раствора метиленовой синьки, закрыть пробкой, перемешать и поставить в термостат при температуре +380С. Изменение окраски в молоке учитывают через 20 мин, 2 часа и 5 часов 30 мин. В зависимости от скорости обесцвечивания краски в молоке определяют количество микробов и оценивают качество молока (см. практикум по микробиологии). Определение количественного и качественного состава микрофлоры молока культуральным методом Для исследований необходимо приготовить разведения молока. Берут 5 пробирок с 9 мл стерильной воды. В первую пробирку вносят 1 мл исследуемого молока и получают разведение 1:10. Из этого разведения переносят во вторую пробирку 1 мл жидкости – получают разведение 1:100 и т.д. Из двух последних разведений засевают по 1 мл в 2 чашки Петри по всей поверхности агара. После этого чашки перевернуть вверх дном и подписать: дата, молоко, разведение, группу, фамилию. Чашки поставить в термостат на 2 суток. Для посева используют следующие питательные среды: МПА – для выявления гнилостной микрофлоры и общего количества микробов; САМ – для выявления молочнокислых микробов, Эндо – для выделения сальмонелл и кишечных палочек. Определение коли - титра. Из молока готовят разведения 1:10, 1:100, 1:1000. Берут 6 пробирок со средой Кесслера-Свенартона. В первые три пробирки со средой засевают по 1 мл из каждого разведения. В остальные пробирки со средой засевают по 0,1 мл каждого разведения. После инкубирования в термостате в течение 2 суток при температуре +430С проводят учет посевов. Если в пробирках нет газа – коли-титр более 3 мл; наличие газа в одной из первых пробирок – коли-титр равен 3 мл, присутствие газа в двух 9 пробирках из трех (4, 5, 6) – коли-титр равен 0,3 мл; если имеется газ в 5 и 6 пробирках – коли-титр менее 0,3 мл (такое молоко нельзя употреблять в пищу). Выделение молочнокислых микробов Каплю сметаны развести в 10 мл стерильной воды и бактериологической петлей посеять на МПА с добавлением гидролизного молока. Культивируют 2 суток при температуре +250С. Характерные для молочнокислых стрептококков колонии (округлые и чечевицеобразные) пересевают на стерильное обезжиренное молоко. Из свернувшегося после культивирования молока делают мазки, окрашивают метиленовой синькой и микроскопируют. Из простокваши бактериологической петлей делают посев на стерильное молоко. Культивируют 2 суток при температуре +400С. Из сыворотки готовят мазки и красят простым способом. Мазки микроскопируют и зарисовывают молочнокислые палочки (болгарская). Микрофлора мяса В мясе, полученном от здоровых животных, микробов нет. При убое больных или утомленных животных микроорганизмы могут проникать в мясо. Кроме того, при разделке туши микробы могут попасть на поверхность мяса из воздуха, со шкуры животного, с рук бойца, ножа и т.д. Микробиологическое исследование мяса проводят с целью выявления микробной загрязненности, наличия возбудителей инфекционных болезней. Из пробы мяса стерильными ножницами вырезают 1 г мяса, которое растирают в стерильной ступке с 10 мл стерильной воды, перемешивают и 1 мл суспензии, засевают на чашку с МПА. Культивируют при температуре +370С. Подсчитывают выросшие колонии и умножают на разведение. Приготовление мазков-отпечатков из мяса. Вырезают кусочек мяса из поверхностного слоя и прикладывают к предметному стеклу. На этом же стекле делают мазок из глубоких слоев мяса. Для этой цели предварительно кусок мяса обжигают на спиртовке и затем стерильными ножницами или скальпелем разрезают, из середины его вырезают кусочек и делают отпечатки. Мазки высушивают, фиксируют и красят по Граму. Свежее мясо – мазок из поверхностного слоя тонкий, едва заметный. Содержит единичные кокки и палочки. В мазке из глубоких слоев микробов нет. Несвежее мясо – мазки толстые, интенсивно окрашены. В мазках с поверхности и из глубоких слоев очень много кокковой и палочковидной микрофлоры. 10 Микрофлора яиц Микробы попадают в яйцо при формировании, а также при хранении. Содержимое яйца – хорошая питательная среда для микробов. Порчу яиц вызывают различные плесневые грибы, гнилостные микроорганизмы. В яйце могут находиться и патогенные микроорганизмы. Чаще всего порче подвергаются яйца при длительном и неправильном хранении. В таких случаях происходит инактивация лизоцима, микробы беспрепятственно размножаются и вызывают порчу яиц. Скорлупу яйца протирают спиртовым тампоном. Стерильным скальпелем вскрывают яйцо, и содержимое выливают в стерильную чашку Петри. Из белка или желтка набирают мерной пипеткой 1 мл жидкости и делают разведения 1:10, 1:100, 1:1000 в стерильной воде. Из разведений делают посевы на питательные среды (МПА) по 1 мл. Посевы культивируют в термостате, через сутки подсчитывают выросшие колонии, которые умножают на степень разведения, и определяют число микробов в 1 мл желтка или белка. Кроме того, из разведения 1:10 или 1:100 бактериологической петлей делают мазок на стекле, высушивают, фиксируют и окрашивают по Граму. Микроскопируют, определяют наличие грамположительной и грамотрицательной микрофлоры. Контроль по теме 1.Назовите возбудителей молочнокислого брожения в следующих продуктах: Кефир - ____________________________________, Сметана - __________________________________, Простокваша - ______________________________, 2.Напишите названия микробов, вызывающих гниение мяса, яиц ___________________________________________________________________ 3.Назовите микробов – возбудителей молочнокислого брожения, исходное сырье, получаемые продукты, а также корма для животных. Название микробов – возбудителей молочнокислого брожения Сырье для брожения Продукты конечного брожения 1. 2. 3. 4. 4.Заполните таблицу по определению качества молока, исследованного вами, по редуктазной пробе. 11 Продолжительность обесцвечивания Количество микробов в 1 мл молока Класс Оценка качества молока Рекомендуемая литература: 1. Артемьева С. А, Артемьева Т. Н., Дмитриев А. П., Дорутина В. В. Микробиологический контроль мяса животных, птицы, яиц и продуктов их переработки: Справочник. Москва, Колос,2002.-288 с. 2. ГОСТ Р 51447-99 (ИСО 3100-1-91). Мясо и мясные продукты. Методы отбора проб. 3. ГОСТ Р 51448-99 (ИСО 3100-2-88). Мясо и мясные продукты. Методы подготовки проб для микробиологических исследований. 5.ГОСТ Р 51446-99 (ИСО 7218) 22.12. 1999 Продукты пищевые. Общие правила микробиологических исследований. 6. Руководство по микробиологии и иммунологии / Н. М. Колычев, и др; гл. ред. В. Н. Кисленко.- Новосибирск: Арта, 2010.- 256 с. 12 Подписано в печать 5.04.2011 г. Формат 60х841/16 Бумага кн.-журн. Усл. п.л. 0,7. Гарнитура Таймс. Тираж 100 экз. Заказ №4900. Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Воронежский государственный аграрный университет имени К.Д. Глинки» Типография ФГОУ ВПО Воронежский ГАУ. 394087, Воронеж, ул. Мичурина, 1 Информационная поддержка: http://tipograf.vsau.ru Отпечатано с оригинал-макета заказчика. Ответственность за содержание предоставленного оригинал-макета типография не несет. Требования и пожелания направлять авторам данного издания. 13
Занятие 4 МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ КОРМОВ
Цель занятия. Ознакомиться с методами санитарно-микробиологического анализа кормов.
Материалы и оборудование. Лабораторные весы; термостат; шуттель-аппарат; эксикатор; стерильные пробирки; пипетки; чашки Петри; фарфоровые ступки; ватно-марлевые фильтры; питательные среды (мясо-пептонные бульон, агар, желатин, лептонная вода, висмут-сульфит-агар, селенитовый бульон, магниевая среда, среды с мочевиной, глюкозой и сернокислым железом, углеводами и индикатором Андраде в сочетании с тимоловым синим, цитратноаммонийная среда, мясо-пептонный желатин, среды Вильсона- Блера, Киллиана, Китта-Тароцци, Кларка, Левина, Плоскирева, Ресселя, Эндо, Эйкмана, кровяной агар по Цейслеру, бульон Хот- тингера, молоко, печеночный бульон); физиологический раствор; индикаторные бумажки; лабораторные животные (белые мыши, морские свинки).
Общие сведения. От каждой партии корма отбирают две средние пробы массой не менее 500 г. Одну направляют в лабораторию, другую сохраняют в хозяйстве до окончания исследования. Для упаковки проб используют стерильную пластмассовую или стеклянную тару.
В пробах корма определяют общую микробную обсемененность, содержание сальмонелл, энтеропатогенных типов кишечной палочки, анаэробов.
Содержание занятия. Определение микробной обсемененности. В стерильную пробирку помещают 1 г корма, взятого из средней пробы, добавляют 9 мл физиологического раствора и тщательно встряхивают (получают разведение 1: 10). Из взвеси готовят последующие разведения (1: 100, 1: 1000, 1: 10 000 и т. д.). После осаждения взвешенных частиц для посевов берут жидкость из верхнего слоя.
Для количественного учета микробов в стерильные чашки Петри вносят по 1 мл из пробирок с разным разведением и доливают 10- 15 мл стерильного, расплавленного и охлажденного до температуры 44-45 °С мясо-пептонного агара (МПА). Осторожно покачивая чашки, засеянный материал равномерно распределяют в агаре. После застывания среды чашки помещают (вверх дном) в термостат при температуре 37 "С на 24-48 ч. После этого подсчитывают выросшие колонии. Полученные результаты умножают на степень разведения, суммируют и определяют количество микробов в 1 г корма.
Пример расчета. В первой чашке обнаружено 200 колоний, во второй - 21, в третьей - 1. В эти чашки посевной материал брали из пробирок с разведениями соответственно 1: 10 000,1:100 000,1:1000 000. Следовательно, в 1 г корма будет содержаться
Микробную обремененность мясо-костной муки можно определить экспресс-методом с применением резазурина. Для этого в одну стерильную пробирку помещают 1 г средней пробы мясо-костной муки, добавляют 10 мл мясо-пептонного бульона (МПБ) и встряхивают, а вдругую пробирку (для контроля) вносят только 10 мл МПБ. Пробирки помещают в термостат при 40 "С на 3 ч. После этого в них добавляют по 1 мл 0,01%-ного раствора резазурина и вновь выдерживают в термостате в течение 2 ч.
Результаты реакций учитывают через каждые 30 мин. По восстановлению резазурина (изменению окраски из синей в розовую) определяют общую микробную обсемененность мясо-костной муки. Если в пробирке с мясо-костной мукой розовое окрашивание наступает позднее чем через 2 ч, то это говорит о том, что в 1 г продукта содержится до 500 тыс. микробов, а при окрашивании в розовый цвет до 2ч - более 500 тыс. микробов.
Контролем служит пробирка с 10 мл МПБ и 1 мл 0,01 %-ного раствора резазурина, выдержанная в термостате при том же температурном режиме и экспозиции и без изменения цвета содержимого.
Исследование на сальмонелл ы. Для анализа берут 50- 200 г исследуемого корма, измельчают его в стерильной фарфоровой ступке и переносят в колбу со средой предварительного обогащения (пептонная вода, МПБ с содержанием 5 % маннита) при соотношении материала и среды 1:5. Содержимое колбы тщательно перемешивают и помещают в термостат при температуре 37 °С. Через 16-18 ч материал высевают в чашки Петри на твердые дифференциально-диагностические среды (висмут-сульфит-агар, среда Плоскирева или Левина) и на две основные среды обогащения (селенитовый бульон, среда Киллиана в соотношении 1:1).
После 16-18 ч выдержки в термостате при 37 °С из сред обогащения делают вторично посевы в чашки с висмут-сульфит-агаром и в чашки со средами Плоскирева и Левина (по выбору) и ставят их в термостат при 37 °С.
Чашки просматривают через 16-24 и 48 ч.
На висмут-сульфит-агаре S. typhi и S.paratyphi А растут в виде мелких, нежных, серовато-зеленых колоний с черным центром, S. cholerae suis - в виде зеленых колоний. Колонии всех других сальмонелл значительно крупнее, темно-коричневого цвета, с металлическим блеском, окруженные светлым ореолом, участок среды под колонией черный. На среде Плоскирева вырастают прозрачные или нежно-розовые колонии, на среде Левина - прозрачные, бледные, нежно-розовые или розовато-фиолетовые.
В случае обнаружения колоний, похожих на сальмонеллы, 3-5 из них высевают на комбинированную среду Ресселя или скошенный агар с мочевиной и бульон Хотгингера для определения индола и сероводорода (под пробирки с бульоном подкладывают специальные индикаторные бумажки). Для определения подвижности культуры делают посев уколом в полужидкий агар (0,3-0,5%-ный).
На среду Ресселя и скошенный агар посевы делают сначала штрихом на скошенной поверхности, а затем уколом в глубину столбика. Если разлагается мочевина в скошенном агаре, то окраска среды меняется на оранжевую при индикаторе BP и на коричнево-фиолетовую при индикаторе тимоловый синий в сочетании с индикато-ром Андраде.
Морфологию культуры изучают в мазках, окрашенных по Граму, и подвижность - в висячей или раздавленной капле или полужидком агаре. Культуры, представляющие грамотрицательные подвижные палочки, ферментирующие глюкозу с образованием газа, не ферментирующие лактозу и сахарозу, не разлагающие мочевину и не образующие индол, исследуют серологически - испытывают в реакции агглютинации (РА) на предметном стекле с набором агглютинирующей адсорбированной поливалентной сальмонеллезной О-сыворотки (группы, А, В, С, D, Е).
Для РА с О-сыворотками культуру следует брать из верхней части скошенного агара, а для агглютинации с Н-сыворотками - из нижней части (конденсационной воды), где микробы наиболее подвижны. По групповой О-сыворотке устанавливают принадлежность культур к той или иной серологической группе.
Исследования на энтеропатогенные типы кишечной палочки. 50 г корма помещают в колбу, содержащую 500 мл стерильного физиологического раствора, встряхивают на шуггель-аппарате в течение 20 мин. Из полученной взвеси стерильными пипетками готовят разведения 1: 100, 1: 1000, 1: 10 000, 1: 100 000, 1: 1 000 000. По 1 мл каждого разведения вносят в пробирки со средой Эйкмана. Посевы помешают в термостат при температуре 43 °С. Через 24 ч учитывают рост по помутнению среды и образованию газа. Титр кишечной палочки устанавливают по наи-большему разведению, в котором еще наблюдался ее рост.
Из пробирок, где наблюдается рост микробов, производят посев на плотные дифференциальные среды (Эндо, Левина, Плоскирева), разделенные на секторы для каждого разведения.
Типичные колонии Е. coli круглой формы, гладкие, выпуклые или слегка приподнятые в центре с ровными краями розового, красного или малинового цвета, с металлическим блеском или без него на среде Эндо или черного цвета на среде Левина.
Выросшие изолированные колонии S-формы (не менее 4) пересевают на МПБ, выдерживают в термостате при температуре 37 °С в течение 16-24 ч. После этого одну часть пробирок используют для приготовления мазков, посевов на дифференциальные диагностические среды, заражения мышей; вторую - для приготовления автоклавированного антигена, если кипяченый антиген не будет агглютинироваться поливалентными (комплексными) коли-сыворотками.
У выделенных культур определяют морфологические и культу-рально-биохимические свойства для установления их родовой принадлежности. Морфологию бактерий изучают в мазках, окрашенных по Граму, их подвижность определяют по характеру роста в 0,3%-ном полужидком МПА.
Для определения культурально-биохимических свойств бактерий используют набор питательных сред (с углеводами и индикатором Андраде, цитратно-аммонийную, мясо-пептонный желатин, МПБ или бульон Хоттингера и агар с глюкозой и сернокислым железом).
Патогенные свойства кишечной палочки определяют путем постановки биологической пробы на белых мышах. Для этого трем мышам массой 14-16 г внутрибрюшинно вводят смывы с суточных агаровых культур в дозе 500 млн микробов. Культуру признают патогенной в случае гибели одной или более мышей в первые 4 сут после заражения.
Исследования на анаэ р об ы. 50 г корма растирают в стерильной ступке, разводят физиологическим раствором и засевают в несколько пробирок со средой Китга-Тароцци, Вильсона-Блера, молоком и в две чашки со средами и кровяным агаром по Цейслеру. Для уничтожения вегетативных форм микробов по одной пробирке с жидкими средами нагревают при температуре 80 °С в течение 20 мин. Посевы помещают в термостат при температуре 37 °С. Чашки должны находиться в специальных аппаратах для анаэробных культур или в эксикаторе, куда заранее вносят тот или иной погло-титель кислорода.
Результаты посевов регистрируют в тот же день. Почернение среды Вильсона-Блера в течение 1 -3 ч после посева, свертывание молока с образованием ноздревато-губчатого сгустка и прозрачной сыворотки в течение 6 ч, а также быстрое начало роста на среде Китта-Тароцци (через 4-5 ч) при обильном газообразовании - характерные признаки присутствия возбудителей Cl. perfringens.
Рост CI. botulinum, наблюдаемый обычно на 2-3 сут, характеризуется помутнением среды Китта-Тароцци, образованием осадка и появлением запаха прогорклого масла.
При обнаружении роста на среде Китта-Тароцци проводят микроскопическое исследование и выделение чистой культуры посевом в 2-3 чашки с кровяным агаром по Цейслеру. Последние выдерживают в анаэробных условиях при температуре 37 °С в течение 24- 48 ч, после чего просматривают рост в чашках и отбирают культуры, которые классифицируют по морфологическим и биохимическим свойствам.
Биологическую пробу ставят на морских свинках или белых мышах, вводя внутрибрюшинно бульонную культуру. При положительном результате подопытные животные погибают через 12-48 ч.
Для идентификации отдельных возбудителей или типов одного вида проводят опыт нейтрализации токсина со специальной сывороткой. Для этого минимальную смертельную дозу культуры в смеси с 0,2-0,5 мл соответствующей типоспецифической сыворотки выдер-живают в термостате 45 мин и вводят мышам внутрибрюшинно. Для контроля испытуемую культуру или фильтрат применяют без сыворотки. Вид и тип микроба определяют по выживаемости мышей.
При исследовании кормов на ботулизм (наличие токсинов) в качестве подопытных животных используют белых мышей. При этом могут быть применены два способа:
а) нейтрализация токсина противоботулиновой сывороткой (антитоксином). Корм предварительно растирают в стерильной ступке, добавляют физиологический раствор (1: 4) и настаивают в течение 1 -2 ч при комнатной температуре. После этого настой центрифугируют и фильтруют через ватно-марлевый фильтр. КО,5 мл фильтрата добавляют 0,2 мл поливалентной противоботулиновой сыворотки. Смесь выдерживают 1 ч при комнатной температуре, затем одному животному вводят подкожно 0,5 мл фильтрата, другому - смесь фильтрата с сывороткой в той же дозе.
Аналогичные испытания могут быть проведены чистой культурой, выращенной (в течение 6-7сут) на печеночном бульоне. В этом случае пастеровской пипеткой отсасывают верхний слой культуры и пропускают через ватно-марлевый фильтр. Далее поступают, как указано выше;
б) разрушение токсина кипячением фильтрата. Фильтрат готовят, как указано в подпункте «а». Одну половину фильтрата кипятят в течение 30 мин. Затем одному животному внутрибрюшинно вводят 0,5-1 мл некипяченого фильтрата, другому - такую же дозу кипяченого.
Положительным результатом биологической пробы по первому и второму способам считают гибель мышей, наступившую как от фильтрата, не обработанного противоботулиновой сывороткой, так и от некипяченого фильтрата.
Главная > Учебно-методическое пособиеЗанятие № 11
Тема : Микробиологическое исследование кормов. Цель занятия: Обучить методам исследования грубых и сочных кормов. Материалы и оборудование : предметные стекла, покровные стекла, препаровальные иглы, посев силоса (10 -6 , 10 -7 разведения) в МПБ, суспензия силоса, индикаторные бумажки для определения рН, посев силоса (10 -6 разведение) на МПА, увлажненные солома и зерно, посев зерна и соломы методом аппликации на МПА. Демонстрация : 1. Рост Cl.perfingens на среде ВильсонБлера; 2. Рост грибков на плотных средах; 3. Рост гнилостных бактерий в МПБ; 4. ИФА для выявления токсина ботулизма. Вопросы для обсуждения : 1. Что такое эпифитная микрофлора и какое ее значение? 2. Почему высушенное сено можно долго хранить? 3. Механизм губительного действия высушивания на микробы. 4. Что лежит в основе силосования корма? Методы силосования сочных кормов. 5. Микроорганизмы, способствующие хорошему качеству силосования. 6. Фазы созревания силосной массы. 7. Методы определения качества силоса.I . Введение
Грубые корма разнообразны в ботаническом отношении и неоднородны в физическом состоянии. Каждый из них имеет свою технологию и способ хранения, при нарушении которых нередко происходит их порча. Так, например, при увлажнении корма создаются благоприятные условия для размножения гнилостной микрофлоры, плесневых грибов, актиномицетов, которые, развиваясь на растении, используют углеводы, белки, витамины и т.д. и тем самым снижают питательную ценность корма. Кроме того, ряд микроорганизмов могут в процессе своей жизнедеятельности выделять целый ряд токсических продуктов, вызывающих отравление животных. Всесторонний качественный и количественный анализ кормов довольно затруднен, так как не существует универсальной среды, на которой можно вырастить все встречающиеся виды микроорганизмов. Чаще всего при анализе грубых кормов определяют: 1) санитарную пригодность корма и его общую обсемененность; 2) наличие споровой микрофлоры, способной вызвать заболевания животных (сибирской язвой, эмфизематозным карбункулом, ботулизмом и др.); 3) микрофлору, вызывающую порчу кормов в процессе их хранения; 4) эпифитную микрофлору, играющую большую роль в процессе силосования (гнилостную, молочнокислую, маслянокислую и др.).
II . Микологическое исследование грубых кормов
Среди микрофлоры, вызывающей порчу грубых кормов, видное место занимают грибы. Известно, что корма, пораженные грибками, могут вызывать микозы и микотоксикозы. Первые возникают при попадании в организм и развитии самого грибка, вторые на почве отравления токсинами (ядовитыми продуктами) грибков, развивающихся на кормах. Поэтому исследование пораженных грибами кормов ведут в двух направлениях: 1) обнаружение и выделение грибковвозбудителей болезней; 2) определение их токсичности. Наиболее токсичные свойства обнаружены у многих видов Aspergillus и Fusarium, встречающихся на соломе и мякине злаков, в почве и различных продуктах. При микологическом исследовании грубых кормов используют препарат “раздавленная капля” или выделяют чистую культуру грибков. Для этого в чашки Петри помещают два кружка фильтровальной бумаги (между которыми кладут тонкий слой ваты), завертывают их и стерилизуют в сушильном шкафу. Перед посевом кружки фильтровальной бумаги увлажняют питательной средой (Чапека или ВанИнтерсена) и раскладывают на них исследуемый корм. Ровные отрезки соломки (1.52 см) располагают по радиусу на расстоянии 12 см друг от друга. Культивирование производят в термостате при температуре 2426 о С в течение 1012 дней. При появлении вокруг соломинок черных, сажистых колоний производят микроскопирование и отсев на косой агар (суслоагар, плотную среду Чапека) для получения чистой культуры. При определении видового состава обращают внимание на строение органов спороношения.
III . Определение токсичности грибков
Для испытания токсичности выделенных культур грибков их размножают на доброкачественной соломе, увлажненной жидкой средой (Чапека или ВанИнтерсена) и простерилизованной в автоклаве при 120 о С в течение 3040 минут. Культивирование грибка производят при 2025 о С в течение 23 недель. Затем культуру убивают текучим паром (в течение часа), соломинки высушивают при 4045 о С и извлекают токсин. Экстрагирование токсина производят этиловым эфиром (в течение 6 часов). Вытяжку сгущают и наносят на свежевыбритый участок кожи кролику (ставят дермонекротическую пробу). В качестве контроля на другой участок выбритой кожи наносят вытяжку, полученную из доброкачественной саломы. Если выделенный гриб образует токсин, то вытяжка из него на 34-е сутки вызовет воспалительную реакцию: отечность, покраснение и омертвление ткани. На месте нанесения контрольной вытяжки изменений на коже не произойдет. Токсин (Аг?) можно определить реакцией преципитации с сыворотками. Элементарным условием сохранения кормов от заплеснения является обеспечение их сухого состояния. Эта задача решается своевременной уборкой кормов, правильным скирдованием и повседневной борьбой с повышением влажности во время хранения.
IV . Исследование кормов на ботулизм
У лошадей и других животных иногда возникают массовые заболевания, связанные с отравлением их токсином ботулизма. Материалом для исследования в этих случаях могут быть остатки несъеденного корма или содержимое желудка падших животных. Внешне этот корм ничем не отличается от доброкачественного, и выделить культуру возбудителя из него не всегда удается. Поэтому прибегают к постановке биологической пробы на морских свинках или выявляют токсин серологическими реакциями. 1. Присланные пробы корма растирают в ступке с постепенным добавлением физраствора (1:2) и оставляют при комнатной температуре на 12 часа. 2. Полученную взвесь фильтруют через бумажный фильтр и центрифугируют. 3. 12 мл полученной жидкости с помощью шприца спаивают двум морским свинкам. При наличии токсина ботулинуса морские свинки погибают в течение 35 суток при явлениях параличей мышц брюшной стенки и задних конечностей. 4. С фильтратом ставят реакции преципитации и ИФА. 5. Из осадка делают посев в две колбы с бульоном КиттТароцци под маслом (предварительно прокипяченным) и быстро охлаждают.
- После посева одну из колб прогревают при 80 о С в течение 20 минут (для уничтожения неспоровых бактерий) и культивируют в термостате при 37 о С в течение 47 дней. При появлении в колбе роста из содержимого делают мазки, окрашивают их по Граму и просматривают с иммерсией. Палочка ботулинуса плектридиальной формы, грамположительная, чистую культуру ее получают в анаэробных условиях на кровяном агаре. Токсичность культуры проверяют на белых мышах, морских свинках или реакциями преципитации и ИФА.
V. Микробиологическое исследование силоса
Силос является одной из главных составных частей кормового рациона сельскохозяйственных животных, поэтому его качественному приготовлению уделяется большое внимание. В основе созревания силоса лежат микробиологические процессы. Одни из этих процессов (как, например, молочнокислое брожение) являются причиной созревания и консервирования силоса, тогда как другие (маслянокислое брожение, гниение) вызывают порчу корма. Оценка качества силоса производится по органолептическим, химическим и микробиологическим показателям. Для контроля за ходом силосования пробы рекомендуется брать в три срока:- в момент закладки силосуемой массы (на количественный и качественный состав эпифитной микрофлоры); после созревания силоса (на 1030-й день после закладки);
Органолептическая оценка силоса
При органолептическом исследовании обращают внимание на физические свойства силоса: структуру, цвет, запах и вкус силосующейся массы. Хороший силос отличается сохранением структур стеблей и листьев. Цвет их под влиянием органических кислот несколько изменяется до желто-оливкового. На воздухе силос быстро темнеет, поэтому определение цвета его следует производить сразу после взятия пробы из силосной массы. Если корм приобрел очень темный цвет, почти черный и стал бесструктурным, это указывает на процессы гниения; такой корм – недоброкачественный.Запах доброкачественного силоса приятный, напоминающий запах свежего ржаного хлеба, квашеной капусты, соленых огурцов или моченых яблок, иногда слегка спиртовой. Последний обуславливается развитием молочно-кислых бактерий и дрожжей. Резко кислый запах указывает на большое содержание уксусной кислоты, что свидетельствует о более низком качестве силоса. Затхлый и гнилостный запах указывает на обильное развитие в силосе плесеней и гнилостных бактерий, вызывающих порчу корма. Неприятный запах придает силосу масляная кислота, образующаяся в результате неправильно проведенного силосования и указывающая на недоброкачественность силоса.Определение кислотности силоса
Наиболее ярким показателем микробиологических процессов, протекающих в силосе, является его рН. Определение производится ионометром или колометрическим методом по Михаэльсу.Для этой цели из силоса готовят вытяжку или путем настаивания в течение суток одной части силоса с 45 частями дистиллированной воды (для прекращения брожения обычно добавляют толуол), или эту навеску силоса (20 г) предварительно растирают в фарфоровой ступке, переносят в колбочку, а затем заливают дистиллированной водой (80 мл). Силос с водой энергично взбалтывают (в первом случае 45 раз, во втором – в течение 5 минут), фильтруют через бумажный фильтр и прозрачный фильтрат сразу используют для определения рН.В доброкачественном силосе рН должно быть не выше 4.04.2.Микробиологическое исследование силоса
Для общего ознакомления с микрофлорой силоса производят его микроскопическое исследование. Для этой цели небольшое количество силоса (12 г) тщательно растирают в стерильной ступке с 12 мл стерильной воды и из полученной массы делают обычным способом мазок. Мазок сушат, фиксируют на пламени спиртовки и окрашивают водным раствором какого-нибудь анилинового красителя. Лучше всего окрашивать мазки из силоса карболовым эритрозином (5%-ный раствор карболовой кислоты 100 мл, сухого эритрозина 2 г); окраска производится в течение 2030 минут. Обычно в мазках, приготовленных из доброкачественного силоса, обнаруживается большое количество палочек, стрептококки, дрожжи. Наличие в препарате плесневых грибков указывает на порчу силоса. Для характеристики качества силоса производят определение общего числа микроорганизмов и их групповой учет. При этом прежде всего готовят разведение силоса (5 г) и переносят его в колбу со 100 мл стерильной воды. Силос с водой энергично взбалтывают в течение 10 минут и из полученного исходного разведения 1:10 готовят последующие разведения. Для приготовления разведения берут 67 пробирок, в которые предварительно наливают по 9 мл стерильной воды. Затем в первую из них пипеткой вносят 1 мл разведения силоса 1:10 (из колбы), тщательно взбалтывают в течение 35 минут и 1 мл полученного разведения 1:100 переносят в следующую пробирку и т.д. Таким образом готовят последующие разведения до 10 -6 10 -7 .Определение в силосе общего количества бактерий
Для этого посев суспензии производят на МПА, в двухкратной повторности. Если силос находится в стадии брожения, для посева берут разведения 10 -6 10 -7 , при исследовании старого силоса 10 -6 10 -5 и даже меньше. Посев производят следующим образом: стерильной градуированной пипеткой асептично берут 1 мл соответствующего разведения (для каждого разведения нужна отдельная пипетка) и вносят в пустую чашку Петри. Затем в чашку наливают предварительно расплавленный и охлажденный до 50 о С мясо-пептонный агар.Учет молочнокислых бактерий
Производят путем посева 34 разведений силосной массы на сусло-агаре с мелом (сусло-агар готовят из пива, разведенного водой 1:1 с добавлением 1.52%-ного агар-агара). Посевы выдерживают 34 дня в термостате при температуре 3035 о С. Вследствие образования кислоты и растворения мела колонии молочнокислых микробов образуют на твердых средах с мелом зоны просветления.Определение количества маслянокислых бактерий
Производят путем посева 34 разведений силоса на картофельную среду Рушмана или на среду Е. Н. Мишустина следующего состава: крахмал 0.5 г; пептон 5.0 г; K 2 HPO 4 1.0 г; мел 5.0 г; водопроводная вода 1000 мл. Среда разливается по пробиркам с поплавками и стерилизуется в автоклаве при 1 атмосфере 20 минут. Различные разведения силосной массы (от 1:100 до 1:10 000) засевают в пробирки с питательной средой в количестве 1 мл (каждое разведение засевают параллельно в 23 пробирки). Часть из них после посева прогревают при температуре 80 о С в течение 1015 минут, а затем засеянные пробирки выдерживают в термостате при температуре 3540 о С до 10 суток. В процессе роста маслянокислых бактерий отмечают газообразование, гидролиз, растворение мела и запах прогорклого масла.Определение гнилостных бактерий
Выполняют с помощью посевов 34 разведений силоса на МПБ, при этом между пробиркой и пробкой вставляют полоску фильтровальной бумаги, смоченную 10%-ным раствором уксуснокислого свинца, и красную лакмусовую бумажку. Гнилостные бактерии вызывают помутнение среды и образование H 2 S, которую определяют по почернению индикаторной бумажки, смоченной уксуснокислым свинцом, или посинению лакмусовой бумажки при выделении аммиака.Определение количества дрожжей и плесени
Производят путем посева силоса на сусло-агар без добавления мела. Посев производят, как описано выше, из разведений силоса 1:1000 1:10000. Засеянные чашки Петри выращивают при температуре 2025 о С и подсчет выросших колоний производят через 4 суток. Для пересчета всех данных рекомендуется пользоваться таблицами МакКреди. Оценка результатов микробиологического исследования силоса Твердых микробиологических норм, характеризующих качество силоса, не имеется, и результаты микробиологического исследования дают лишь общее представление о ходе процессов в силосе. Показателями нормально протекающего процесса созревания силоса являются: низкое рН (4), преобладание молочнокислых бактерий (110 млн.), небольшое количество плесеней (до 4 тыс.), бактерий группы кишечной палочки (2500 млн.) и маслянокислых бацилл (250 млн.). Зрелый силос, в котором правильно протекали микробные процессы, беден микроорганизмами, в то же время силос богат органическими и минеральными веществами, которые находятся в легкоусвояемой форме. Все это делает силос ценным пищевым продуктом для сельскохозяйственных животных. Ход работы : I. Определить титр Cl.perfingens на среде ВильсонБлера:- Взвесить 0.1 г измельченного корма, поместить в колбу с 10 мл стерильного физиологического раствора и тщательно взболтать в течение 5 минут; Затем 1мл полученной суспензии внести в стерильную чашку Петри и залить питательной средой ВильсонБлера (100 мл 3%-ного МПА и 1%-ной глюкозы); растапливают в водяной бане и добавляют 10 мл 20%-ного раствора сульфита натрия и 1 мл 8%-ного хлористого натрия. Оба раствора готовят на стерильной дистиллированной воде и кипятят; Через сутки инкубирования в анаэростате при 37 градусах чашки Петри просматривают и отмечают результаты:
- Пораженное растение тщательно осмотреть и установить наличие или отсутствие спороношения; Выявленные на поверхности пораженной ткани спороношения в виде налета подушечек или плодовых тел снять препаровальной иглой и перенести на предметное стекло в каплю 50%-ного раствора глицерина или молочной кислоты;
- Налет расправить иглами, накрыть покровным стеклом и изучить с сухими системами микроскопа (8´15 и 40´7); Промикроскопировать, изучить морфологию грибков, зарисовать.
Занятие № 12
Тема : Микробиологическое исследование молока и молочнокислых продуктов. Цель занятия: Обучить методам исследования молока и молочнокислых продуктов. Материалы и оборудование : Стерильная посуда (пипетки, микропипетки, чашки Петри, пробирки, скальпель), набор красителей, предметные стекла, 1%-ный водный раствор метиленовой синьки, жидкость Никифорова, МПА (высокие столбики), стерильная водопроводная вода по 9 мл в пробирках и по 20 мл, молоко, кисломолочные продукты (сметана, кефир или кефирные зерна). Демонстрация : 1. Опыт в пробирках для определения редуктазы в молоке. 2. Опыт в чашках Петри для определения лизоцима в молоке. 3. Чашки с ростом для определения микробного числа молока. 4. Стерильные среды Эндо, Козера, Кесслера с глюкозой. 5. Среды с ростом БГКП Кесслера, Эндо, Козера и среда с глюкозой. Вопросы для обсуждения : 1. Источники микрофлоры молока. 2. Смена фаз при хранении молока. 3. Молоко как возможный источник патогенных микробов. 4. Порок молока, микробы – участники. 5. Какие вам известны способы консервирования молока? 6. Методы микробиологического исследования молока. 7. Как взять пробу молока для бактериологического исследования? 8. Какими требованиями должно отвечать молоко группы А? 9. Какие вы знаете кисломолочные продукты? 10. Какие микроорганизмы участвуют в молочнокислом брожении? 12. Микробиология маслоделия, сыроделия. 13. Какие вы знаете пороки микробного происхождения, связанные с хра- нением масла и сыра?I . Введение
Молоко является продуктом питания и средой для развития микроорганизмов. Качество молока определяется рядом показателей физических, химических и бактериологических. Физические и химические показатели характеризуют питательную ценность молока, а бактериологические позволяют судить о свежести молока и степени его загрязнения. При помощи этих показателей можно контролировать санитарные требования при дойке, обработке, хранении и транспортировке молока. Некоторые бактериологические показатели (наряду с физическими и химическими) характеризуют состояние вымени животного, т. е. наличие или отсутствие в нем воспалительного процесса. Микрофлора молока складывается из ряда источников: 1) микрофлора вымени; 2) внешние источники заражения молока (кожа животного, посуда и аппаратура, вода, корм, подстилка, воздух, тело и одежда доярки) как источники первичной микрофлоры молока. Вторичная микрофлора молока это накопление микрофлоры в молоке путем размножения ранее попавших в него микроорганизмов.
II . Взятие материала для исследования молока
В зависимости от поставленных задач исследования пробы молока берут от одной определенной коровы или от группы коров. При взятии пробы молока от одной коровы: 1) готовят стерильную посуду; 2) вымя коровы тщательно моют теплой водой с мылом, протирают стерильным полотенцем, соски дезинфицируют ватным тампоном, смоченным спиртом; 3) доильщицы тщательно моют и дезинфицируют руки; 4) из каждого соска поочередно молоко сдаивают в стерильную посуду: а) первые 34 струйки (при исследовании это микрофлора кожи животного), в пищу они не идут и не уничтожаются; б) средние струйки (микрофлора молока); в) последние струйки (микрофлора вымени). При исследовании последних струек молока и наличии в них лейкоцитов и микроорганизмов можно выявить мастит (воспаление молочной железы). Все пробы этикетируются и направляются на исследование в лабораторию.При взятии молока от группы коров: 1) молоко во флягах тщательно перемешивают мутовкой медленными круговыми движениями; 2) забор проб молока производят стерильным пробником (длинная стеклянная трубка) в количестве 50 мл и сливают в стерильный флакон. Флакон закрывают над пламенем спиртовки ватной пробкой. Нумеруют, на этикеткеуказывают дату взятия пробы (число и час), а также фамилию, имя, отчество и должность лица, производившего взятие пробы. Исследование взятых проб молока производят сразу или не позднее 2-х часов с момента взятия проб. Если молоко не может быть немедленно исследовано, то его охлаждают до + 46 о С, хранят и транспортируют при этой же температуре.Основными бактериологическими показателями, характеризующими свежесть молока и его чистоту, являются: а) количество бактерий в 1 мл молока (микробное число), б) коли-титр молока (наименьший объем молока, в котором обнаружена одна БГКП). Микробное число молока можно определить: 1) бактериологическим способом (высев определенного объема молока на специальные среды с последующим подсчетом выросших колоний; 2) методом прямого подсчета бактерий под микроскопом (метод Брида, Королева, Разумовой и т.д.); 3) косвенными методами : а) с помощью пробы на редуктазу; б) с помощью пробы с резазурином.
Микробиологическое исследование
молочнокислых продуктов
Типичные молочнокислые бактерии неподвижны, Гр (+), слабо или совсем не растут на МП-ых средах. Молочнокислые бактерии молока при сбраживании углеводов образуют в основном молочную кислоту, побочные продукты обычно мало заметны. Но встречаются молочнокислые бактерии, которые при брожении наряду с молочной кислотой образуют значительное количество летучих кислот (уксусной, углекислоты), спирт, диацетил и при развитии совместно с активными молочнокислыми бактериями придают молочным продуктам своеобразный специфический вкус и аромат. Молочнокислые микроорганизмы представлены тремя группами: молочнокислые стрептококки, молочнокислые палочки, дрожжи. Ход работы: I. Определить количество бактерий в 1 мл молока (методом посева):
- Приготовить серийное разведение молока: а) взять 4 пробирки с 9 мл водопроводной воды и подписать: № 1, 2, 3, 4; б) взятую пробу молока тщательно взболтать и стерильной пипеткой набрать из нее 1 мл молока и внести в пробирку № 1, тщательно перемешать, соблюдая все правила асептики, и перенести в пробирку № 2 и т.д. Вы получите разведения молока: № 1 (1:10), № 2 (1:100), № 3 (1:1000), № 4 (1:10000).
- Взять 1 стерильную чашку Петри, подписать "молоко 1:10000". В чашку внести 1 мл из пробирки № 4, залить чашку расплавленным и охлажденным до 4550 о С МПА (15 мл). Образовавшуюся смесь тщательно перемешать путем вращения чашки и оставить на столе до полного застывания агара.
- Чашку перевернуть вверх дном и поставить в термостат на 48 часов.
- По демонстрационным чашкам подсчитать микробное число.
- Приготовить мазок из сметаны, высушить на воздухе, зафиксировать в жидкости Никифорова и окрасить метиленовой синькой (3 мин). Мазок промыть, подсушить фильтровальной бумагой. Промикроскопировать с иммерсионной системой. Отметить наличие молочнокислых стрептококков, палочек и дрожжей, сбраживающих лактозу. Приготовить мазок из кефира: а) зерно кефира поместить между двумя стерильными стеклами и раздавить его; б) полученные на стекле отпечатки высушить, зафиксировать и окрасить метиленовой синькой, промикроскопировать, зарисовать и отметить наличие единичных дрожжей, молочнокислых стрептококков, молочнокислых бактерий и палочки стромы.
Занятие № 13
Тема : Препараты, используемые для лечения, профилактики и диагностики инфекционных заболеваний сельскохозяйственных животных. Цель занятия: Изучить вакцины, сыворотки, иммуноглобулины, аллергены и способы их применения. Материалы и оборудование: Набор препаратов лечебного, профилактического и диагностического назначения в животноводстве. Вопросы для обсуждения : 1. Вакцины, их назначение, виды вакцин. 2. Иммунные сыворотки, их назначение. 3. Способы получения лечебно-профилактических препаратов. 4. Иммуноглобулины, их назначение. 5. Аллергены, их получение и использование. 6. Диагностические сыворотки, их получение, применение. 7. Диагностикумы, их получение, применение. 8. Применение бактериофагов для лечения и диагностики.I . Профилактические и лечебные препараты
Одним из важнейших направлений прикладной иммунологии является создание эффективных препаратов для иммунопрофилактики и иммунотерапии инфекционных заболеваний. Среди таких препаратов различают: 1. Вакцины и анатоксины. 2. Иммунные сыворотки и иммуноглобулины.
Вакцины
Вакцины препараты, используемые для активной иммунизации людей и животных. Э.Дженнером была получена первая вакцина, содержащая вирус коровьей оспы (vacca - корова). Название вакцины было дано Л. Пастером всем прививочным препаратам, полученным из микроорганизмов и их продуктов. Вакцины должны обладать определенными свойствами (физико-химическими, антигенными) и при правильном дозировании и введении животным давать соответствующую реакцию и создавать активный иммунитет против той или иной болезни.Различают вакцины живые, убитые, субъединичные, генно-инженерные и другие. Живые вакцины изготовляют из специально полученных штаммов микроорганизмов с ослабленной вирулентностью и полноценными иммуногенными свойствами. Для этого вначале прибегают к селекции и направленному изменению бактериальных культур и вирусов (на фоне сохраненной антигенной структуры). Это достигается: выращиванием возбудителя в средах, недостаточно для его развития благоприятных (туберкулезная вакцина в БЦЖ); пассажами через организм маловосприимчивых животных (вакцина против рожи свиней, вакцина против бешенства, вакцина против вируса чумы свиней и вируса Ньюкастловской болезни); обработкой химическими веществами и физическими агентами (вакцины против пастереллеза птиц, против сибирской язвы (СТИ, ГНТИ), вакцины Ценковского, бруцеллеза ВА-19, против паратифа телят Т с -177). Живые вакцины обычно более эффективны, создают, как правило, напряженный иммунитет, сходный с постинфекционным. В большинстве случаев достаточно бывает однократной вакцинации живой вакцины, так как вакцинный штамм может размножаться и персистировать в организме.Однако после их применения могут возникнуть поствакцинальные осложнения, особенно у животных с пониженной резистентностью к заболеваниям. Вакцины чаще леофильно высушивают: из замороженного состояния, в вакууме. Убитые вакцины представляют собой взвесь убитых (инактивированных) микроорганизмов. Их готовят из штаммов микроорганизмов, обладающих максимально выраженными иммуногенными свойствами. Для инактивации вакцин используют разные методы: нагревание, УФ-лучи, ультразвук, химические вещества (спирт, формалин, фенол и другие). Инактивацию проводят в условиях, исключающих денатаруцию антигенов. Примерами убитых вакцин могут служить: формолвакцина против эмфизематозного карбункула, формолвакцина против оспы свиней и против паратифа телят. Вакцины, содержащие убитые микробы, безопасны, вызывают медленное образование иммунитета и менее эффективны в условиях действующего очага инфекции. Следует учитывать, что аттенуированный (ослабленный) или убитый возбудитель это множество различных антигенных детерминант, из которых протективностью, т.е. способностью индуцировать защитный иммунитет, обладают очень немногие. В связи с этим целесообразно усовершенствовать вакцины путем использования компонентов бактериальной клетки и вирионов, обладающих наиболее выраженным протективным действием. Вакцины, содержащие отдельные антигенные комплексы микробных клеток и вирионов, называют субъединичными . При введении их в организм субъединичные вакцины благодаря хорошей растворимости и относительно низкой молекулярной массе быстро метаболируются и выводятся из организма, не обеспечивая длительного иммуногенного раздражения. Поэтому к ним обычно добавляют вещества-адъюванты (adjuvans - помогающий): гидроокись аммония, алюмо-калиевые квасцы, фосфаты аммония, кальция и другие. Адъюванты укрупняют антигенные частицы, созюдают в месте введения депо (депонированные вакцины), т.е. удлиняют период иммуногенного раздражения. Кроме того, адъюванты усиливают фагоцитоз, митоз иммунокомпетентных клеток. Генно-инженерные вакцины получают поэтапно. Сначала составляют генетическую карту генома данного возбудителя. Затем гены, контролирующие протективные антигены, переносят в геном других микроорганизмов, например в дрожжевую клетку или кишечную палочку, клонируют в них, добиваясь экспрессии этих генов в новых условиях. Синтезируемые новыми клетками антигены (белки) очищают от балластных веществ и адсорбируют на адъювантах. Созданы генно-инженерные вакцины против ящура, бешенства. Ассоциированные вакцины . Большое значение в животноводстве имеет ассоциированная иммунизация, т.е. введение в организм ассоциированных вакцин, содержащих одновременно антигены нескольких возбудителей, например: ассоциированная вакцина против эмфизематозного карбункула, злокачественного отека и пастереллеза крупного рогатого скота, ассоциированная вакцина против ботулизма и пастереллеза норок.
Анатоксины
Анатоксины используют для создания искусственного активного антитоксического иммунитета (столбняк, ботулизм и другие). Анатоксин представляет собой экзотоксин (фильтрат бульонной культуры токсигенного микроба), обезвреженный длительным (1830 дней) воздействием формалина при температуре 3740 о С. Анатоксин контролируют на стерильность, безвредность и иммуногенность. Анатоксины очищают от балластных белков и адсорбируют на адъювантах.
Иммунные сыворотки и иммуноглобулины
При многих бактериальных и вирусных инфекциях антитела играют защитную роль, нейтрализуя токсины и внеклеточные вирусы, способствуют очищению организма от возбудителя. Однако накопление достаточного количества антител наблюдается, как правило, не ранее чем через 23 недели после начала заболевания. Поэтому для создания искусственного пассивного иммунитета используют введение животным иммунных сывороток или иммуноглобулинов.Сыворотки применяют с профилактическими и лечебными целями. Для профилактики их используют, когда имеется непосредственная опасность заражения, например, столбняком, анаэробными инфекциями при ранении. Сыворотку вводят чаще внутримышечно или внутривенно. Иммунные сыворотки получают путем многократной иммунизации лошадей, от которых можно получить сравнительно много крови. Животных иммунизируют соответствующими антигенами: анатоксинами для получения антитоксических сывороток и вакцинами для получения антибактериальных и антивирусных сывороток. После окончания иммунизации у животного стерильно берут кровь, из которой получают сыворотку. Сыворотку проверяют на активность (титр антител), стерильность, безвредность, очищают от балластных белков. Чаще для этого применяют метод ферментативного гидролиза, осаждение активных фракций сульфатом аммония и диализ «Диаферм» . Из сывороток получают иммуноглобулины путем спиртоводного осаждения при низкой температуре. Из крови гипериммунизированных животных получают иммуноглобулины против бешенства, сибирской язвы, чумы, лептоспироза и т.д.
II . Диагностические препараты
Диагностические препараты используются для: 1) определения с помощью специальных иммунных сывороток вида и типа микроорганизма, выделенного от больного животного; 2) обнаружения антител в сыворотке больного животного;
- выявления аллергической перестройки организма, возникающей при некоторых инфекционных заболеваниях.
Диагностические сыворотки
Диагностические сыворотки содержат специфические антитела, с их помощью можно выделить антигены соответствующего возбудителя. Диагностические сыворотки подразделяются на агглютинирующие, преципитирующие, нейтрализующие, люминисцентные, меченые (конъюгированные) ферментом и другие.
Все диагностические иммунные сыворотки готовят путем иммунизации животных (кроликов, лошадей) соответствующим антигеном. Полученные от иммунизированных животных сыворотки титруют (определяют титр соответствующих антител), в стерильных условиях разливают в ампулы. Свободные аминогруппы F c фрагментов антител в иммунных сыворотках можно конъюгировать ферментами, флюоресцентными красителями, изотопами. Эти сыворотки используют для диагностики в реакциях ммунофлюоресцентного и иммуноферментного анализа, радиоиммунного анализа.Диагностикумы
Диагностикумы используют для определения специфических антител в сыворотке животного. Чаще всего диагностикумы представляют собой гомогенную взвесь убитых микробов или вирусов. Диагностикумы из большинства бактерий готовятся путем инактивации их взвеси формалином, этиловым спиртом, прогреванием и другими методами.В ряде случаев для серодиагностики применяют не целые микроорганизмы, а выделенные из микробных тел антигены. Это достигается различными методами: дезинтеграцией химическими веществами, кипячением, ультразвуком и т.д.
Бактериофаги
Бактериофаги характеризуются высокой специфичностью, поэтому их можно использовать для: 1) фаготерапии лечения некоторых инфекционных заболеваний; 2) фагопрофилактики предупреждения некоторых заболеваний; 3) диагностики.
Аллергены
Аллергены это препараты, которые применяют с целью диагностики соответствующего заболевания, для выявления иммунологической перестройки организма в результате вакцинации или заболевания. Основные требования к аллергенам высокая чувствительность и специфичность.Микробные аллергены чаще готовят из фильтратов бульонных культур. Вводят накожно, внутрикожно или на конъюктиву глаза. При положительной реакции на месте введения аллергена развивается местная воспалительная реакция: отечность, гиперемия, выделение гноя из внутреннего угла глаза и др. Ход работы: I. Изучить вакцины: а) живые вакцины БЦЖ, СТИ, б) убитые вакцины, в) субъединичные вакцины. II. Изучить анатоксины: столбнячный, ботулинический. III. Изучить иммунные сыворотки и иммуноглобулины. Просмотреть образцы следующих сывороток: а) сыворотку против сибирской язвы, б) сыворотку против паратифа поросят,в) поливалентную сыворотку против лептоспироза. IV.Изучить аллергены. Просмотреть образцы следующих аллергенов: а) альтуберкулин Коха, б) туберкулин ППД, в) бруцеллизат ВИЭМ, г) бруцеллин ВИЭМ. Разобрать способы введения. V. Изучить диагностические сыворотки: а) агглютинирующую сальмонелезную поливалентную, б) агглютинирующую сальмонелезную групповую О-сыворотку, в) агглютинирующую сальмонелезную типовую Н-сыворотку, г) люминесцирующую сыворотку чумную, д) люминесцирующую сыворотку бруцеллезную, е)преципитирующую сибиреязвенную сыворотку. Просмотреть образцы сывороток, разобрать способы их приготовления, применения. VI. Изучить диагностикумы: а) сальмонелезный ОН-диагностикум, б) бруцеллезный диагностикум, в) эритроцитарный сибиреязвенный диагностикум, г) бруцеллезный эритроцитарный диагностикум. Просмотреть образцы диагностикумов, разобрать способы их получения, применения. VII. Изучить бактериофаги: а) для лечения: стафилококковый, стрептококковый, б) для диагностики: чумной диагностический фаг. Тесты для проверки знаний: 1. Туберкулины для аллергодиагностики животному вводят: а) внутрикожно, б) внутривенно, в) внутримышечно, г) на конъюктиву. Ответ: а, г 2. Для активной иммунизации против сибирской язвы животным вводят: а) противосибиреязвенную сыворотку, б) вакцину СТИ, в) вакцину ГНТИ, г) противосибиреязвенный иммуноглобулин, д) вакцины Ценковского. Ответ: б, в, д 3. Живые вакцины: а) содержат иммуноглобулины, б) создают пассивный иммунитет организма, в) создают активный иммунитет, г) состоят из аттенуированного штамма. Ответ: в, г Ключевые слова : вакцины, иммунные сыворотки, иммуноглобулины, аллергены, диагностикумы, бактериофаги.
ЛИТЕРАТУРА
- Вирусные инфекции. Труды института имени Пастера. С.-Пб.: НИИ эпидемиологии и микробиологии, 1992. 122 с. Кочемасова З.Н. и др. Санитарная микробиология и вирусология. М.: Медицина, 1987. 440 с. Красильников А.П. Микробиологический словарь-справочник. Минск: Беларусь, 1986. 210 с. Краткий определитель бактерий. Под ред. Дж. Хоулта. М.: Мир, 1980. 312 с. Лукомская К.А. Микробиология с основами макробиологии. М.: Мир, 1987. 120 с. Покровский В.Н. Бактериофаг – вирус бактерий. М.: Знание, 1986. 310 с. Пяткин К. Д. Микробиология. М.: Медицина, 1971. 352 с.
- Стейниер Р., Эдельберг Э., Дж. Ингрэм. Мир микробов. Т.1, 2, 3. М.: Мир, 1979. 270 с.
ПРЕДИСЛОВИЕ ………………………………………………………………. 3 Раздел I. МОРФОЛОГИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ 1. Правила работы в бактериологической лаборатории. Техника приготовления и простая окраска препаратов. Морфология микроорганизмов ……………………………………………. 4
- Структура бактериальной клетки. Сложные методы окраски ………….. 7
Предисловие (66)
ДокументПРЕДИСЛОВИЕ Центральный государственный архив научно-технической документации Казахской ССР (ЦГА НТД КазССР) Главного архивного управления при Совете Министров Каз ССР образован постановлением Совета Министров Казахской ССР от 7 февраля
Предисловие (73)
РассказПредисловие Основой рассказов являются подлинные события. Начинаются они разделом "Дороги старокрымских партизан к победе". В нем читатель познакомится не только с геройскими делами партизан, но и убедится, что в годы Великой
Эпифитная микрофлора. Микрофлору, находящуюся на поверхности растений, называют эпифитной (поверхностной). Как правило, эта травяная палочка Bact.herbicola, занимающая около 40 % всей эпифитной микрофлоры, молочнокислые стрептококки и палочки, сенная и картофельная бациллы, флюоресцирующие бактерии, протей, сарцины, актиномицеты, плесени, дрожжи и др.
Эпифитная микрофлора представлена главным образом безвредными сапрофитами, однако при скашивании растений они могут интенсивно размножаться, вызывая гнилостные и бродильные процессы, приводящие к порче и разложению корма. Для предотвращения этих процессов растительные корма консервируют. Наиболее эффективным способом консервирования скошенной травы, зерна и других кормов является сушка. Сено сушат в прокосах, валках, копнах, на вешалах с помощью принудительной вентиляции атмосферным или подогретым воздухом. При этом, однако, следует иметь в виду, что пересушивание зеленой массы приводит к потере питательных веществ, особенно протеина и каротина. При увлажнении высушенного корма в нем вновь возникают микробиологические процессы, приводящие к повышению температуры, т. е. происходит термогенез (самонагревание) за счет деятельности вначале мезофильной, а затем термофильной микрофлоры. При умеренном развитии самонагревания солома, например, становится самопрелой и лучше поедается скотом. Явление микробного термогенеза в районах с влажным климатом используют для приготовления так называемого бурого сена.
Силосование (заквашивание) кормов. Это лучший способ консервирования зеленого корма, при котором растительную массу укладывают в силосные ямы, траншеи, башни и другие сооружения. Для понимания сущности процессов, происходящих при силосовании, необходимо детально знать биохимию и микробиологию его.
Существует два способа силосования: холодный и горячий. При холодном способе, имеющем наибольшее распространение, в созревающем силосе происходит умеренное повышение температуры — до 25— 30 °С. Растительная масса в этом случае укладывается в траншею одномоментно, утрамбовывается и изолируется слоем земли.
При горячем способе силосная траншея заполняется по частям, без утрамбовки, с перерывами в 1—2 дня. При таком силосовании обеспечивается аэробиоз, более интенсивно идут микробиологические и ферментативные процессы, в результате которых температура корма повышается до 45—50 °С. Затем укладывают второй слой толщиной до 1,5 м, третий, и так до полного заполнения траншеи. Горячий способ силосования применяется реже, поскольку разогревание растительной массы приводит к потере питательных веществ. Его целесообразно использовать для силосования грубо-стебельчатых кормов из малоценных трав, а также соломы.
В процессе созревания зеленой массы при холодном силосовании различают три последовательные фазы:
первая фаза (развития смешанной микрофлоры) связана с бурным размножением эпифитной микрофлоры, кишечной палочки, псевдомонаса, дрожжей, молочнокислых и гнилостных бактерий. Длительность первой фазы — 1—3 дня. В это время силос разогревается и подкисляется, создаются анаэробные условия, в результате чего большая часть смешанной микрофлоры погибает;
вторая фаза характеризуется вначале бурным размножением молочнокислых стрептококков, а затем молочнокислых палочек, продуцирующих молочную кислоту, которая подавляет размножение гнилостных и маслянокислых микроорганизмов, кроме споро-образующих. Длительность второй фазы от 2 нед до 3 мес;
третья фаза (конечная) связана с постепенным отмиранием в созревающем силосе возбудителей молочнокислого брожения (Sir. lactis, Str. plantarum, Str.thermophilus), концентрация молочной кислоты достигает 60 % и более, рН силосной массы снижается до 4,2—4,5. Кроме молочной кислоты в силосе накапливаются уксусная и даже масляная кислоты. Концентрация уксусной кислоты не должна превышать 40—60 % всех органических кислот, масляной кислоты должно быть не более 0,2 %.
При несоблюдении технологии приготовления силоса и его хранения он может заплесневеть, прогоркнуть и перекиснуть. Для профилактики пороков силоса микробного происхождения используют бактериальные закваски молочнокислых бактерий (Lactobacillus plantarum, Str. lactis diastaticus), пропионово-кислых и других бактерий. Кроме того, используют буферные кислотные смеси, содержащие разные минеральные кислоты, а также препараты, содержащие формиат кальция, метабисульфит, пиросульфит натрия, сульфаминовую, бензойную, муравьиную кислоты и другие вещества.
Дрожжевание кормов. Для обогащения кормов белком и витаминами используют кормовые или пивные дрожжи. Дрожжевание производят заквасочным или опарным методом. (Технология их дана в специальной литературе.)
Сенаж. Изложенные выше сведения относятся к консервированию кормов, имеющих нормальную влажность (около 75 %). Если влажность консервируемой массы значительно ниже (50— 65 %), то происходит хорошая ферментация даже при дефиците углеводов и получается корм высокого качества — сенаж. При этом рН корма может быть довольно высоким — около 5, так как гнилостные бактерии обладают меньшим осмотическим давлением, чем молочнокислые. При подсушивании корма в нем приостанавливаются гнилостные процессы, но продолжают действовать возбудители молочнокислого брожения. На этом основано приготовление сенажа, когда несколько подсушенную массу закладывают для консервирования, как при холодном силосовании.
Исследованиями авторов было показано, что в клевере, влажность которого составляла 50 % и ниже, развиваются микробиологические процессы. Они протекают тем слабее, чем суше корм. Доминирующей микрофлорой в консервируемом корме очень быстро становятся молочнокислые бактерии. Эта группа довольно специфичных микроорганизмов близка к Lactobacillus plantarum, но отличается способностью расти в условиях значительно более сухой среды и сбраживать крахмал. Их развитие в корме приводит к накоплению в нем некоторого количества молочной и уксусной кислот.
По типу сенажирования хорошо сохраняются предназначенные на корм измельченные початки кукурузы с влажностью 26—50 % (оптимум 30—40 %). В последнее время рекомендуют обрабатывать недосушенное сено (влажностью около 35 %) жидким аммиаком, который действует как консервант. При введении аммиака в корме создается щелочная реакция, блокирующая микробиологические и ферментативные процессы. Обработанный аммиаком корм должен быть покрыт каким-либо изоляционным материалом (Е. Н. Мишустин, В. Т. Емцев, 1987).
Эпифитная микрофлора растений. Прикорневая и корневая система растений обсеменена большим количеством различной микрофлоры. В корневой зоне (ризосфере) имеется большое количество отмирающих корневых остатков, являющихся питательным субстратом для сапрофитной почвенной микрофлоры. Эти бактерии относятся к гнилостным, как и некоторые представители кишечной группы, встречающиеся в корневой зоне растений. Кроме них ризосфера содержит значительное количество гетероферментативных молочнокислых бактерий. Количество спорообразующих становится значительным лишь после отмирания корневой системы. Из плесневых грибов преобладают Penicillium, Fusarium.
Некоторые бактерии и микроскопические грибы, обитающие у корня, постепенно переходят на наземную часть растущего растения и расселяются на ней. На поверхности растений способна существовать лишь определенная группа микроорганизмов, получившая название эпифитной. На поверхности растений содержатся аммонификаторы, маслянокислые бактерии, молочнокислые бактерии, бактерии группы кишечной палочки (БГКП) и представители других физиологических групп микроорганизмов. В отличие от других микробов эпифиты хорошо переносят действие фитонцидов, солнечных излучений и питаются веществами, выделяемыми растениями. Находясь на поверхности растений, эпифиты не повреждают и не проникают в ткани здорового растения. Большая роль в этом процессе принадлежит естественному иммунитету и бактерицидным веществам, которые выделяют растения. Все растения выделяют фитонциды, которые влияют на физиологические процессы микробов.
Взаимоотношения между микробами и скошенными растениями. После скашивания растений нарушается проницаемость клеток, разрушаются бактерицидные вещества, которые препятствовали проникновению микробов в их ткани. Активизируются все микроорганизмы, находившиеся на поверхности растений: гнилостные, маслянокислые, молочнокислые бактерии и плесневые грибы и др. Микроорганизмы, и в первую очередь грибы, при интенсивном их развитии снижают качество корма и его питательную ценность. Под действием Aspergillus, Penicillium изменяются жиры, затем углеводы и белки, в корме накапливаются различные продукты распада, резко изменяющие запах и вкус корма, среди них органические жирные кислоты, аммиак и пептоны. Эти процессы особенно активно протекают при высокой влажности и температуре.
В глубинных слоях корма развиваются анаэробные бактерии, а на поверхности - аэробные бактерии и плесневые грибы. В результате их жизнедеятельности происходит разложение составных частей корма, что приводит к потере питательных веществ и порче корма. Он приобретает гнилостный запах, волокна легко разрываются, их консистенция становится мажущейся. Такой корм плохо поедается животными и может вызвать кормовые отравления.
С е н о. Сушка – старый и наиболее распространенный способ консервирования зеленой массы и других кормов (зерно, солома). Суть этого процесса заключается в том, что при сушке микробиологические процессы в корме приостанавливаются из-за удаления из него «свободной» воды, которая составляет большую часть имеющейся в корме влаги. Так, если в свежей траве содержится 70-80% влаги, то в сене всего 12-16%. Оставшаяся в корме вода представляет собой «связанную» воду и не может поддержать развитие микроорганизмов. Таким образом, задача сушки – удаление избыточной воды из корма с наименьшей потерей органических веществ. При сушке число жизнедеятельных микроорганизмов, находящихся на поверхности кормов, постепенно уменьшается, но, тем не менее, в них всегда можно найти большее или меньшее число эпифитной и сапрофитной микрофлоры, попавшей из воздуха и почвы. Размножение сапрофитной микрофлоры в результате повышения влажности приводит к заметному повышению температуры. Это повышение температуры, связанное с жизнедеятельностью микроорганизмов, получило название термогенез.
Приготовление обыкновенного сена. Сено готовят из скошенных трав, которые имеют влажность 70-80% и содержат большое количество свободной воды. Такая вода создает благоприятные условия для размножения эпифитной микрофлоры, вызывающей гниение травы. Высушивание травы до влажности 12-17% приостанавливает микробиологические процессы, что прекращает разрушение высушенных растений.
После высушивания в сене сохраняется большое количество эпифитной микрофлоры, но так как при этом нет условий для их размножения, то они находятся в анабиотическом состоянии. При попадании воды на высушенное сено деятельность микроорганизмов начинает активизироваться, что приводит к повышению температуры до 40-50 0 С и выше. При самонагревании растительной массы происходит четко выраженная смена микрофлоры. Сначала в греющейся массе размножаются мезофильные бактерии. С повышением температуры на смену им приходят термофилы, способные развиваться при температуре до 75-80 0 С. Обугливание растительной массы начинается с температуры около 90 0 С, при такой температуре микроорганизмы прекращают свою деятельность, дальнейшие процессы протекают химическим путем. Образуются горючие газы – метан и водород, которые адсорбируются на пористой поверхности обуглившихся растений, вследствие чего может произойти самовоспламенение. Воспламенение происходит лишь при наличии воздуха и недостаточно уплотненной растительной массе.
Микроорганизмы используют не всю энергию потребленных ими питательных веществ, избыток энергии выделяется в окружающую среду главным образом в виде тепла. Чем выше температура согревающегося корма, тем ниже его качество. Но не всегда явление термогенеза вредно. В северных районах, где мало тепла и высокая влажность, его используют для приготовления бурого сена.
Приготовление бурого сена распространено в тех районах, где по климатическим условиям затруднена сушка сена. Для просушивания корма применяют не солнечную энергию, а тепло, выделяемое в результате жизнедеятельности микроорганизмов, развивающихся в растительной массе. Скошенную и хорошо провяленную траву складывают в небольшие копны, затем в стога и скирды. Так как в растительной массе еще содержится свободная вода, начинают размножаться микроорганизмы, выделяется тепло, которое и досушивает растения. Через месяц при угасании микробиологических процессов происходит охлаждение растительной массы, которая может храниться длительное время. Сено, приготовленное таким образом, теряет естественную окраску, становится бурым, но охотно поедается животными.
Сенаж – это разновидность консервированного корма, получаемого из провяленных трав, главным образом бобовых, убранных в начале бутонизации.
Научные исследования, проведенные в последние годы, показали, что особенно перспективным способом консервирования различных трав, и в первую очередь клевера и люцерны, является приготовление из них так называемого сенажа.
Технология приготовления сенажа включает скашивание, плющение и закладку провяленной травы в хранилище. Получить доброкачественный сенаж и до минимума сократить его потери при хранении можно только при закладке корма в капитальные хранилища – башни и траншеи. Траншеи по сравнению с башнями более просты и удобны в эксплуатации. Для приготовления высококачественного сенажа в хранилища закладывают мелко измельченные растения (размер частиц 2-3 см), что обеспечивает сыпучесть и уплотнение корма, тщательно утрамбовывают массы и, что очень важно, заготовку сенажа надо провести в 2-4 дня, т.е. в сжатые сроки. Недостаточное уплотнение и продолжительные сроки закладки вызывают нежелательное повышение температуры, что ухудшает перевариваемость и потери органического вещества корма. После загрузки хранилища сенаж укрывают слоем свежескошенной травы, затем полиэтиленовой пленкой и сверху слоем земли и торфа.
От степени герметизации хранилища зависит сохранность и качество сенажа, т.к. при доступе воздуха начинаются гнилостные процессы, приводящие к порче корма.
В отличие от обычного силоса, сохранность которого обусловливается накоплением органических кислот до рН 4.2-4.4, консервирование сенажа достигается за счет физиологической сухости исходного сырья, сохраняемого в анаэробных условиях . Если влажность консервируемой массы будет в пределах 40-50%, то она хорошо ферментируется и даже при дефиците углеводов дает корм высокого качества. При этом рН корма может быть довольно высоким – около 5,0. Это объясняется тем, что гнилостные бактерии обладают меньшим осмотическим давлением, чем молочнокислые бактерии. При подсушивании корма в нем приостанавливаются гнилостные процессы, но продолжают действовать возбудители молочнокислого брожения. На этом основано приготовление сенажа, когда несколько подсушенную массу закладывают в специальную траншею, как при холодном силосовании.
Сенаж по своим свойствам ближе к зеленой массе, чем обычный силос. Это пресный корм, его кислотность соответствует величине рН 4.8-5.0, в нем почти полностью сохраняется сахар, в то время как у силоса он превращается в органические кислоты.
При указанной влажности растений интенсивно развиваться может лишь плесень. Плесени являются строгими аэробами, поэтому непременным условием приготовления сенажа, является надежная изоляция его от воздуха. Оставшийся в консервируемой массе воздух быстро используется на дыхание еще живыми клетками растений, и все свободное пространство между частицами измельченного корма заполняется углекислым газом.
Таким образом, для приготовления доброкачественного сенажа необходимо выполнить два условия:
1) снизить влажность растительной массы до 45-55%;
2) создать строгие анаэробные условия , чтобы предотвратить развитие гнилостных бактерий и плесневых грибов.
Тем не менее, технология приготовления сенажа основана не только на физических, но и на микробиологических процессах, которые протекают медленнее, чем в силосе. В силосе максимальное количество микроорганизмов накапливается уже к 7-му дню, а в сенаже их численность достигает максимума только на 15-й день, т.е. молочнокислое брожение в сенаже протекает значительно слабее, чем при силосовании и зависит от влажности и вида консервируемого сырья. Поэтому показатель рН в сенаже выше, чем в силосе и колеблется от 4,4 до 5,6. По данным А.А Зубрилина с соавторами (1967), количество молочнокислых микробов в сенаже в 4-5 раз меньше, чем в силосе. В связи с этим, в сенаже, по сравнению с силосом, содержится больше не использованного сахара . Так, если в силосе весь сахар превращается в органические кислоты, то в сенаже сохраняется около 80% сахара. В результате создания неблагоприятных условий для развития микрофлоры в консервируемом корме, исключения утечки сока и механических потерь листьев и соцветий при заготовке и хранении сенажа, общие потери питательных веществ в сенаже не превышают 13-17%. Таким образом, сенаж совмещает в себе положительные качества сена и силоса .
В отличие от силоса сенаж, имея низкую влажность, не замерзает, что упрощает его выгрузку и скармливание животным. Сенаж можно заготавливать из всех трав, т.к. в отличие от силоса, не имеет значения, сколько в траве содержится легкосбраживаемых углеводов, и к какой группе по силосуемости относятся эти растения.
Микробиология силосования кормов. Термин «силос» (silos) очень древнего происхождения, на испанском языке означает «яма» для хранения зерна (в настоящее время, утратившее свое первоначальное значение). Такие зернохранилища были распространены во многих местностях побережья Средиземного моря. Еще за 700 лет до нашей эры землевладельцы Греции, Турции, Северной Африки широко использовали такие ямы для хранения зерна. Со временем этот принцип был использован для хранения и консервирования зеленой массы.
Силосование – сложный микробиологический и биохимический процесс консервирования сочной растительной массы.
Суть силосования заключается в том, что в результате сбраживания растительных углеводов ферментами молочнокислых бактерий, в силосуемой массе накапливается молочная кислота, обладающая антимикробными свойствами , в результате чего корм не подвергается гниению и приобретает стойкость при хранении.
Для получения силоса хорошего качества и с наименьшими потерями необходимо соблюдать определенные условия.
1. Использовать для силосования корма, содержащие достаточное количество легкосилосующихся углеводов (кукуруза, подсолнечник, горох, зеленый овес, луговые злаки) или добавлять их в несилосующиеся растения.
2. Необходимо хорошо изолировать силосуемую массу от воздуха для создания анаэробных условий , при которых создаются неблагоприятные условия для размножения гнилостных и плесневых микроорганизмов
3. Силосуемый корм должен иметь оптимальную влажность - 65-75%, при которой происходит интенсивное образование органических кислот. При пониженной влажности силосуемая масса плохо уплотняется, в ней много воздуха и создаются условия для самонагревания, развития плесени и гнилостных бактерий.
4. В силосуемой массе должна быть оптимальная температура для развитиия молочнокислых бактерий 25-30 0 , при этой температуре идет нормальный процесс заквашивания корма с небольшими потерями питательных веществ. Готовый силос получается умеренно кислый, желто-зеленого цвета, с приятным специфическим запахом.
Биохимизм микробиологических процессов при силосовании .
Бактерии, вырабатывающие молочную кислоту, представляют собой большую разнообразную группу, в которую входят как кокковидные, так и палочковидные формы.
Молочнокислые бактерии по качеству конечных продуктов брожения делят на две основные группы:
Гомоферментативны е, образующие из сбраживаемых ими углеводов в основном молочную кислоту и лишь следы различных побочных продуктов. Типичные представители этой группы – молочнокислые стрептококки и молочнокислые палочки. При таком брожении получается продукт с приятным кислым вкусом и запахом.
Гетероферментативные, образующие, кроме молочной кислоты, значительное количество побочных продуктов (этилового спирта, уксусной кислоты, углекислого газа). Среди них имеются кокковые и палочковидные формы.
Для развития всех молочнокислых бактерий в растительной массе должны быть легкоусвояемые углеводы. Способность вырабатывать молочную кислоту изменяется у одного и того же вида микроорганизмов от многих факторов, в том числе и от качества питательного субстрата. Так, при сбраживании гексоз они образуют в качестве главного продукта молочную кислоту, которая получается в результате расщепления одной молекулы сахара на две молекулы молочной кислоты по следующему уравнению:
С 6 Н 12 О 6 = 2С 3 Н 6 О 3
При сбраживании пентоз в конечных продуктах брожения будет всегда больше уксусной кислоты, чем при сбраживании, например гексоз - глюкозы или фруктозы. А так как пентозаны входят в состав растительной массы, наличие в готовом силосе уксусной кислоты также является результатом жизнедеятельности молочнокислых, а не уксуснокислых бактерий. Поэтому даже в хорошем силосе всегда находится определенное количество уксусной кислоты. (Даниленко И.А. с соавт.,1972). И, если в составе органических кислот будет не менее 65-70% молочной, а уксусной 30-35%, то значит, брожение происходило правильно. Известны два способа силосования: холодный и горячий.
Холодный способ силосования характеризуется тем, что созревание силоса происходит при температуре 25-30 0 С. При таком силосовании измельченную растительную массу плотно укладывают в траншею, а сверху изолируют от воздуха для создания анаэробных условий, при которых развитие гнилостных бактерий и плесневых грибов подавляется. Непременным условием получения высококачественного корма является быстрая изоляция силосуемой массы от воздуха, поэтому продолжительность заполнения траншеи измельченной зеленой массой не должна превышать 3-4 дней. Для предотвращения самосогревания (термогенеза) необходимо укладывать измельченную зеленую массу быстро и непрерывно, при постоянном уплотнении.
При горячем способе силосования зеленую массу укладывают рыхло, слоем 1,0-1,5 м на 1-2 дня, затем укладывают второй слой такой же толщины, как и первый. При доступе кислорода в растительной массе развиваются энергичные микробиологические процессы, в результате чего температура корма поднимается до 45-50 0 С. Нижний слой растений, размягченный высокой температурой, спрессовывается под тяжестью нового слоя корма. Это вызывает удаление воздуха из нижнего слоя, поэтому аэробные процессы прекращаются, и температура начинает снижаться. Последний верхний слой утрамбовывают и плотно прикрывают для защиты от воздуха. Перегретый силос имеет коричневый цвет, запах яблок или ржаного хлеба, хорошо поедается животными. Однако кормовая ценность силоса, приготовленного горячим способом, значительно ниже, чем при холодном способе.
Процесс силосования можно условно разделить на три фазы.
Первая фаза силосования называется фазой смешанной микрофлоры . В растительной массе начинается бурное развитие эпифитной микрофлоры (гнилостной, молочнокислой, маслянокислой, микроскопических грибов, дрожжей), внесенной с кормом. Продолжительность первой фазы зависит от качества корма, плотности укладки, температуры окружающей среды, но чаще бывает кратковременной.
Во вторую фазу – фазу главного брожения – основную роль играют молочнокислые бактерии, выделяющие молочную кислоту. При оптимальном содержании сахара в растительной массе интенсивное молочнокислое брожение приводит к образованию значительного количества органических кислот (в основном молочной), которое необходимо для подкисления корма до рН 4,2-4,4. В начале этой фазы размножаются кокки, затем, по мере нарастания кислотности, им на смену приходят кислотоустойчивые молочнокислые палочки. Молочная кислота обладает антимикробными свойствами, поэтому большинство гнилостных бактерий погибает, но спорообразующие формы в виде спор могут длительное время сохраняться в силосованном корме.
Третья фаза – конечная - связана с постепенным отмиранием возбудителей молочнокислого брожения в созревающем силосе. Молочная кислота при накоплении в большой концентрации становится вредной и для молочнокислых палочек, которые наряду с оставшимися кокками начинают отмирать. Таким образом, количество бактерий в корме уменьшается, и процесс силосования подходит к естественному завершению.
В состав эпифитной микрофлоры растительного сырья входят различные микроорганизмы (микроскопические грибы, маслянокислые бактерии, кишечная палочка), которые при нарушении технологического процесса могут активизироваться и вызывать нежелательные процессы.
Плесневые грибы хорошо переносят кислую среду (рН до 1,2) и активно размножаются в силосе при плохой изоляции от воздуха. Для своей жизнедеятельности они используют углеводы, а при их недостатке – молочную и уксусную кислоты. При этом значительно ухудшается качество силоса и отмечается токсическое воздействие заплесневелого корма на организм животного. Надежными мерами для предотвращения развития плесневых грибов в силосе являются хорошая герметизация силосохранилищ и создание благоприятных условий для развития молочнокислого брожения.
Бактерии группы кишечной палочки являются гетероферментативными микроорганизмами, которые кроме сахаролитических выделяют и протеолитические ферменты, расщепляющие растительные белки до аммиака, таким образом, снижая ценность силосуемого корма.
Нежелательны для процесса силосования и маслянокислые бактерии , являющиеся строгими анаэробами. В процессе жизнедеятельности они используют сахар, молочную кислоту, некоторые аминокислоты. Это сопровождается гнилостным распадом белка, накоплением масляной кислоты и других, вредных для организма животных побочных продуктов. Наличие масляной кислоты является индикатором гнилостного разложения белка при слабом нарастании в силосе молочной кислоты. Снижение рН среды до 4,2 предотвращает развитие маслянокислого брожения при силосовании кормов.
Дрожжевание кормов. Это микробиологический метод подготовки кормов к скармливанию. В химическом составе дрожжей содержится 48-52% белков, 13-16% углеводов, 2-3% жиров, 22-40% безазотистых экстрактивных веществ и 6-10% золы. В состав дрожжей входят многие незаменимые аминокислоты: аргинин, гистидин, лизин, лейцин, тирозин, треонин, фенилаланин, метионин, валин, триптофан, которых мало в кормах растительного происхождения. В дрожжах много витаминов группы В, провитамин витамина D 2 , а также витамины Е, С и др. И в отличие от других источников белка они обладают большой скоростью размножения и нетребовательны к качеству источников питательных веществ. Применение дрожжей не случайно, например, 500 кг дрожжей дают за сутки 80 кг белков, а у быка, того же веса, суточный привес составляет в лучшем случае 500 -800 г белка.
При дрожжевании кормов необходимо создать благоприятные условия для размножения дрожжевых клеток: наличие легкосбраживаемых углеводов, содержащих моно- или дисахариды, достаточной аэрации (иначе дрожжи перейдут на анаэробный тип дыхания, конечным продуктом которого является этиловый спирт), благоприятной температуры 25-30 0 С и рН в пределах 3,8-4,2. Для дрожжевания хорошо подходят кормовые смеси приготовленные из отходов зернового производства, корнеплодов, жома, к которым примешивают грубые корма, т.е. смеси богатые углеводами и бедные протеином (исключить корма животного происхождения, на которых развиваются гнилостные, маслянокислые и другие нежелательные микроорганизмы).
Для дрожжевания кормов необходимо подобрать сухое и светлое помещение, чтобы предотвратить загрязнение дрожжеванного корма спорами плесневых грибов, среди которых могут быть возбудители микотоксикозов.
Существует три способа дрожжевания кормов: безопарный, опарный и заквасочный.
Безопарный способ характеризуется тем, что 1% разведенных дрожжей вносят сразу во всю массу корма. Смесь перемешивают каждые 30 мин в течение 8-10 часов, затем корм готов к скармливанию.
При опарном способе , вначале готовят опару, которую потом вносят в дрожжуемый корм. Для этого дрожжи (1% от массы корма) разводят и смешивают с одной пятой корма, выдерживают 6 часов при перемешивании. Затем в опару добавляют остальной корм, двойное количество воды и процесс дрожжевания идет еще 3 часа при постоянном перемешивании для доступа воздуха.
Заквасочный способ применяют при недостаточном количестве дрожжей, поэтому вначале готовят закваску. Для этого 0,5 кг прессованных дрожжей размножают в небольшом количестве хорошо дрожжующихся углеводистых кормов (отходы зернового производства) при 30-35 0 С, через 5 часов их можно использовать как закваску. Заготовленную порцию корма осолаживают, обливая их кипятком, – осолаживание происходит в течение 5 часов при температуре не ниже 60 0 С. К осоложенному корму добавляют такое же количество воды и половину закваски , перемешивают и оставляют на 6 часов в теплом месте, после чего корм готов к скармливанию. Вторую часть оставшейся закваски можно использовать 5-10 раз для дрожжевания новых партий корма, после чего она теряет активность.
Дрожжевание кормов улучшает качество корма и обогащает корм витаминами, а присутствие молочной кислоты увеличивает у животных аппетит.
